纳米孔肽测序获突破：南京大学团队实现单氨基酸分辨率序列读取

2026年7月29日，南京大学化学化工学院黄硕教授团队在《自然》(Nature)期刊在线发表题为"Sequential reading of a stepwise-shortened peptide immobilized on nanopore"的研究论文，报道了一种基于纳米孔的"边切边测"肽段测序新策略，实现了单氨基酸分辨率的肽序列读取。

　　蛋白质作为生命活动的核心执行者，其序列信息是解析生物过程与疾病机制的关键。传统测序技术在灵敏度与动态范围上存在明显局限，难以满足低丰度蛋白及翻译后修饰的精准解析需求。受纳米孔核酸测序成功经验的启发，近年来基于纳米孔的肽段测序技术受到广泛关注，但由于肽链组成和结构的复杂性，如何在连续读取过程中产生分布窄、一致性高且具有序列依赖性的信号事件，一直是该领域的核心技术难题。

　　针对这一挑战，黄硕团队提出了一种名为"瞬态孔分析物成环"(transient Pore Analyte Looping，tPAL)的纳米孔肽测序策略。研究团队通过遗传密码子扩展技术，对耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)纳米孔进行工程化改造，构建了具有双重反应位点的纳米孔传感平台。在该平台中，待测肽分子的C端被共价锚定在孔道下沿，其游离N端则与孔道识别区修饰的次氮基三乙酸-镍离子(NTA-Ni)适配器形成可逆配位结合，从而实现对单个肽分子的连续、重复测量。

　　在此基础上，研究团队进一步引入经胆固醇修饰的氨肽酶。借助胆固醇基团与磷脂膜之间的疏水相互作用，氨肽酶被定向富集在孔道周围，对锚定在孔道上的单条肽链进行逐个氨基酸的顺序水解。在此过程中，NTA-Ni适配器同步识别每一步酶切后暴露出的新肽链N端，输出与肽段序列高度相关的特征电流信号。研究团队还定制开发了一套机器学习算法，对测序信号进行识别与解码，最终重构出完整的肽序列。

　　实验结果表明，该方法实现了单氨基酸分辨率的肽序列读取，能够直接识别肽链中的单个氨基酸突变、翻译后修饰以及非天然氨基酸插入。研究团队还验证了该方法对手性肽的测序分析能力，展示了其在纳米孔蛋白质组学和手性肽分析中的广泛适用性。

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